Mi az a modRNA vakcina és miért lehet benne DNS-maradvány? A modRNA vakcinák előállításához egy DNS-sablonra van szükség, amelyről az RNS-polimeráz enzim lemásolja a módosított mRNS-t [2, 4]. Ezt a DNS-sablont elvileg el kell távolítani a végtermékből, de a korábbi vizsgálatok azt mutatták, hogy ez nem mindig sikerül tökéletesen [2, 4]. A “maradvány plazmid DNS” tehát a gyártási folyamatból visszamaradt, nem kívánt DNS-darabokat jelenti [2, 5].

A kutatás módszerei: A kutatók 32 vakcinás fiolát vizsgáltak meg (16 egyedi tételszámból) a kanadai Ontario-ból [2, 3, 6]. Két független módszert alkalmaztak:

1. Qubit fluorometria: Ez a módszer a teljes DNS mennyiségét méri [2, 3, 7]. Fontos megjegyezni, hogy az mRNS befolyásolhatja a mérést, ezért RNáz A enzimmel kezelték a mintákat, hogy lebontsák az mRNS-t és pontosabb DNS-mennyiséget kapjanak [2, 8-10].
2. Kvantitatív polimeráz láncreakció (qPCR): Ez a módszer specifikus DNS-célpontokat (plazmid eredetű szekvenciák, spike protein szekvenciák és az SV40 promóter-enhancer-ori szekvencia) kvantifikál [2, 3, 11]. A DNS-fragmentumok hosszát Oxford Nanopore szekvenálással is elemezték [2, 12]. Megvizsgálták továbbá, hogy a DNS védett-e a lipid nanorészecskékben (LNP-kben) a DNáz I enzim lebontó hatása ellen [2, 13, 14]. Végül, a DNS-szintek és a vakcinákhoz jelentett mellékhatások (AEs és súlyos mellékhatások, SAEs) közötti esetleges összefüggéseket is vizsgálták a VAERS (Vaccine Adverse Event Reporting System) adatbázisból [3, 8].

Főbb eredmények és következtetések:

1. DNS-maradványok mennyisége és a szabályozási határértékek túllépése:

• Teljes DNS (Qubit fluorometria): Az összes vizsgált fiola teljes DNS-mennyisége meghaladta az amerikai FDA és a WHO által meghatározott 10 ng/adag szabályozási határértéket [2, 15, 16].
  • Pfizer: 371–1 548 ng/adag tartományban mozgott, ami 36–153-szorosa a határértéknek [2, 9, 16].
  • Moderna: 1 130–6 280 ng/adag tartományban mozgott, ami 112–627-szerese a határértéknek [2, 9, 16].
  • A Moderna vakcinákban konzisztensen sokkal magasabb volt a teljes DNS mennyisége, mint a Pfizer vakcinákban [9].
• Specifikus DNS-célpontok (qPCR):
  • SV40 promóter-enhancer-ori: Ez a szekvencia csak a Pfizer fiolákban volt kimutatható (0,25–23,72 ng/adag) [2, 17, 18]. Hat Pfizer tételből kettő (3 fiola) kétszeresen meghaladta az SV40 promóter-enhancer-ori esetében a szabályozási határértéket [2, 18]. Az SV40 promóter-enhancer elem jelenléte a Pfizer fiolákban jelentős biztonsági aggályokat vet fel [2]. Ez az elem elősegítheti a nukleáris célzást, és daganatkeltő potenciállal is összefüggésbe hozható [19].
  • Egyéb specifikus DNS-célpontok (spike, ori):
    • Pfizer: 0,22–7,28 ng/adag [2, 18].
    • Moderna: 0,01–0,78 ng/adag [2, 18].
    • qPCR-rel vizsgálva az összes Moderna fiola a szabályozási határértéken belül volt [2].
• Módszertani különbségek: A qPCR módszer hajlamos alulbecsülni a teljes DNS-mennyiséget, mivel nem tudja kvantifikálni a nagyon rövid fragmentumokat [16, 20, 21]. Ez magyarázza a Qubit fluorometria és a qPCR eredményei közötti nagy különbségeket [21]. Ezért a pontos DNS-terhelés meghatározásához több módszer alkalmazása is elengedhetetlen [16].

2. DNS-fragmentumok hossza és védettsége:

• Az Oxford Nanopore szekvenálás szerint egy Pfizer fiolában az átlagos DNS-fragmentum hossza 214 bp (bázispár) volt, a leghosszabb pedig 3,5 kb (kilobázispár) [2, 22].
• A vizsgálatok kimutatták, hogy a vakcinákban lévő DNS-t a lipid nanorészecskék (LNP-k) védik a lebomlástól, azaz nem volt hozzáférhető a DNáz I enzim számára [14, 23].

3. Gyártási folyamatok és szabályozási hiányosságok:

• A Pfizer megváltoztatta a gyártási folyamatát az FDA jóváhagyása után (1-es folyamatról 2-esre), áttérve a PCR-amplifikációról egy PCR-mentes tisztítási eljárásra, hasonlóan a Modernához [24]. Valószínűsíthető, hogy ez a változás jelentősen megnövelte a maradék DNS mennyiségét a végtermékben [24].
• A szabályozási határértékeket (10 ng/adag DNS és kevesebb mint 200 bp méret a funkcionális gének esetében) “csupasz” DNS-re állapították meg, nem pedig LNP-be csomagolt, védett DNS-re, amely nukleáris célzási szekvenciákat is tartalmazhat [15, 19, 25].
• A lipid nanorészecskék 10-100-szorosára növelhetik a DNS sejtbe jutásának és transzfekciójának hatékonyságát [23, 25]. Ezt a tényezőt, valamint a kumulatív adagolás kockázatait sem vették figyelembe a jelenlegi iránymutatások kialakításakor [23, 25].
• Folyamatos ingadozást tapasztaltak a maradék DNS mennyiségében, különösen a Pfizer vakcinákban, ami a gyártási folyamat inkonzisztenciájára utal [26].

4. Mellékhatások és lehetséges kockázatok:

• Előzetes elemzésük korrelációt mutatott ki a VAERS-be jelentett súlyos mellékhatások (SAE-k) és a DNS-szintek között, különösen az “ori” szekvencia esetében [27].
• Azok a Pfizer tételek (lila kupakos, PBS formulációjú), amelyek a legtöbb mellékhatással és súlyos mellékhatással jártak, magas DNS-szinttel is rendelkeztek [28].
• A Moderna szabadalma is felhívja a figyelmet a beépülési mutagenezis és az onkogének aktiválódásának, vagy a tumorszuppresszor gének gátlásának kockázatára, ha genetikailag módosított DNS-t (plazmid DNS-t) juttatnak be lipid nanorészecskékbe csomagolva [29, 30].
• A kutatók hangsúlyozzák, hogy a DNS-fragmentumok véletlenszerű összetétele megnehezíti a DNS-szintek és a specifikus mellékhatások közötti közvetlen összefüggés megállapítását, mivel a genotoxikus hatások a szekvenciától és a gazdasejttel való kölcsönhatástól függően változhatnak [31]. A magasabb DNS-terhelés hosszú távú egészségügyi kockázatokhoz is hozzájárulhat, mint például a genomikus integrációból eredő rák [31].
• A VAERS adatbázis elsősorban rövid távú mellékhatásokat rögzít, és alulreprezentálhatja a hosszú távú hatásokat [31].

Összefoglalás és ajánlások: A kutatás kimutatta, hogy a vizsgált modRNA COVID-19 vakcinákban adagonként több milliárd-százmilliárd DNS-molekula található [16]. A fluorometria (RNáz A kezeléssel) alapján minden termék 36–627-szeresen meghaladta az FDA és a WHO által meghatározott 10 ng/adag DNS-határértéket [16]. Bár a qPCR szerint a Moderna fiolák határértéken belül voltak, 3 Pfizer fiola meghaladta az SV40 promóter-enhancer-ori határértéket, és nagyobb tételen belüli és tételek közötti variabilitást mutatott [16].

A tanulmány szerint a qPCR alulbecsüli a teljes DNS-mennyiséget, ezért a pontos DNS-terhelés meghatározásához több vizsgálati módszerre van szükség [16, 20]. Az újonnan vizsgált XBB.1.5 Moderna és Pfizer vakcinák is tartalmaztak DNS-maradványokat [16].

A szerzők hangsúlyozzák, hogy az iránymutatásokat felül kell vizsgálni, figyelembe véve a DNS lipid nanorészecskék általi hatékony transzfekcióját és a kumulatív adagolás kockázatát [16, 32]. A munka megismétlésére van szükség „forenzikus körülmények között”, és a szabályozó hatóságoknak és az iparágnak be kell tartaniuk az elővigyázatosság elvét, elegendő és átlátható bizonyítékot kell szolgáltatniuk a termékek biztonságosságáról és hatékonyságáról, valamint fel kell tárniuk az összetételük és gyártási módszereik részleteit [32].